審評(píng)四部 張明平
保證產(chǎn)品無菌是注射劑產(chǎn)品質(zhì)量保證的核心問題。無菌生產(chǎn)工藝是保障注射劑產(chǎn)品無菌的關(guān)鍵手段。而只有經(jīng)過充分驗(yàn)證后的滅菌（無菌）生產(chǎn)工藝，才能保證生產(chǎn)出無菌的產(chǎn)品。微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)是無菌生產(chǎn)工藝驗(yàn)證的重要環(huán)節(jié)。而選擇適當(dāng)?shù)纳镏甘緞﹦t是微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果獲得認(rèn)可的關(guān)鍵。本文將圍繞如何為終端滅菌工藝（過度殺滅和殘存概率法）選擇適當(dāng)?shù)纳镏甘緞┻M(jìn)行討論。
滅菌是指殺滅所有形式微生物的過程。在業(yè)界，常用“無菌保證水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念來評(píng)價(jià)滅菌（無菌）工藝的效果，SAL的定義為產(chǎn)品經(jīng)滅菌/除菌后微生物殘存的概率。該值越小，表明產(chǎn)品中微生物存在的概率越小。為了保證注射劑的無菌安全性，G際上一致規(guī)定，采用濕熱滅菌法的SAL不得大于10-6，即滅菌后微生物存活的概率不得大于百萬分之一。生物指示劑就是為了保證整個(gè)滅菌過程達(dá)到SAL 水平而應(yīng)用的,它能綜合反映影響滅菌效果的各種因素。因此為了保證驗(yàn)證結(jié)果的重復(fù)性，生物指示劑應(yīng)當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)化的菌株（即變異性小，各項(xiàng)生物學(xué)特征均一性好的菌種），并且應(yīng)當(dāng)具備合乎要求的抗力。更重要的是，參照USP的要求“It must be established that the biological indicator system provides a challenge to the sterilization process that exceeds the challenge of the natural microbial burden in or on the product.”，我們應(yīng)當(dāng)選擇比現(xiàn)有生產(chǎn)線自然環(huán)境下所發(fā)現(xiàn)的菌株更難殺滅的菌株來作為生物指示劑。舉例來說，比如通過對(duì)現(xiàn)有車間環(huán)境、生產(chǎn)線、人員、物料兩年的的連續(xù)觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有生產(chǎn)條件下所發(fā)現(xiàn)的菌株的D值**高不超過0.8，則選擇D值在0.8～1.5之間的生孢梭菌( Clostridium sporogenes；ATCC7955)為生物指示劑進(jìn)行驗(yàn)證就是不合適的。而如果在現(xiàn)有生產(chǎn)條件下所發(fā)現(xiàn)的菌株的D值**高不超過0.6，則可以選擇生孢梭菌為生物指示劑。
只要滿足以上兩個(gè)原則（標(biāo)準(zhǔn)化菌株及合乎要求的抗力），生產(chǎn)企業(yè)可以自行選擇、研究、培養(yǎng)生物指示劑（前提是提供充分的生產(chǎn)環(huán)境和驗(yàn)證菌株的研究資料）；也可以選擇商用的生物指示劑產(chǎn)品，如Bacillus stearothermophilus（嗜熱脂肪芽孢桿菌）、Clostridium Sporogenes（生孢梭菌）、Bacillus subtilis （枯草芽孢桿菌）、Bacillus coagulans（凝結(jié)芽孢桿菌）等菌種的孢子。不論采用何種驗(yàn)證菌株，參照USP，對(duì)濕熱滅菌（121℃）的工藝驗(yàn)證用菌株均應(yīng)證明“具備合乎要求的抗力”；通常應(yīng)滿足以下要求：D值在1.5～3.0之間；存活時(shí)間在4.5～14.0min之間；完全殺滅時(shí)間在13.5～32.0min之間。為了表征菌株的“抗力”，可參照USP<55> BIOLOGICAL INDICATORS—RESISTANCE PERFORMANCE TESTS的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化程序，測(cè)定D值、存活時(shí)間和殺滅時(shí)間，并提交相關(guān)的驗(yàn)證資料。
但在大多數(shù)情況下，在申報(bào)新藥時(shí)G內(nèi)企業(yè)缺乏對(duì)車間環(huán)境、生產(chǎn)線、人員、物料連續(xù)兩年的檢測(cè)資料。在這種情況下企業(yè)不能自行選擇“新”的生物指示劑，而應(yīng)當(dāng)選擇為目前業(yè)界熟知的一些生物指示劑。目前，嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(ATCC 7953)已成為驗(yàn)證濕熱滅菌程序的**常用的生物指示劑。采用該菌株進(jìn)行滅菌工藝驗(yàn)證通常不再需要企業(yè)提供連續(xù)兩年的微生物環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果。
驗(yàn)證過程通常為將一定量已知耐熱性的孢子接入產(chǎn)品中, 用設(shè)定的滅菌程序滅菌, 以確認(rèn)設(shè)定的滅菌工藝是否符合標(biāo)準(zhǔn)。然而有的產(chǎn)品可能會(huì)增加微生物的耐熱性, 有的產(chǎn)品可能會(huì)殺滅微生物或與之不相容, 在后一種情況下, 可考慮用生理鹽水或與產(chǎn)品相似的溶液替代產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。所以研究滅菌程序之前, 必須了解生物指示劑在產(chǎn)品或替代產(chǎn)品中的耐熱性。即參照USP<55>的要求對(duì)D值進(jìn)行測(cè)定。其中規(guī)定“The requirements of the test are met if the determined D value is within 20% of the labeled D value for the selected sterilizing temperature and if the confidence limits of the estimate are within 10% of the determined D value.”。即測(cè)定的D值應(yīng)該為標(biāo)定值的80～120%（置信區(qū)間為10%以內(nèi)）。此外，企業(yè)有責(zé)任對(duì)購買的指示劑產(chǎn)品的純度和分類學(xué)特征進(jìn)行研究，**少應(yīng)當(dāng)確定該微生物的“種”；并詳細(xì)說明供應(yīng)商提供的菌種的D值范圍、適用的滅菌條件、存儲(chǔ)條件、出廠時(shí)間、過期時(shí)間、菌種穩(wěn)定性等資料。當(dāng)該生物指示劑存儲(chǔ)時(shí)間較長或者擬進(jìn)行驗(yàn)證的滅菌條件與生產(chǎn)商的說明不符時(shí)，必須重新測(cè)定指示劑的D值、存活時(shí)間和殺滅時(shí)間。
在使用生物指示劑時(shí)容易忽視的一點(diǎn)就是——所有關(guān)于滿足SAL不得大于10-6的產(chǎn)品就是無菌產(chǎn)品的假設(shè)都是建立在原產(chǎn)品中的微生物量（bioburden，生物負(fù)荷）不超過每單位壹佰萬個(gè)。因此應(yīng)當(dāng)檢測(cè)生物指示劑每個(gè)單劑量中的微生物孢子數(shù)。參照USP要求“The requirements of the test are met if the average number of viable spores per carrier is not less than 0.3 log of the labeled spore count per carrier and does not exceed the log labeled spore count per carrier by 0.48.”；即單劑量包裝中的孢子數(shù)不低于標(biāo)示量的0.3Log，亦不得過標(biāo)示量的0.48Log。
總而言之，選擇恰當(dāng)?shù)纳镏甘緞瑘?zhí)行正確的步驟，并提供系統(tǒng)完整的信息，才能使無菌生產(chǎn)工藝驗(yàn)證結(jié)果令人信服。
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